СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛИПИДНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ И ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ СПЕРМИЕВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Вестник Курганской ГСХА. 2023. № 1 (45). С. 33-39
Vestnik Kurganskoj GSHA. 2023; (1-45): 33-39
Научная статья
УДК 636.22/28.082.2 EDN: JUMZSR
Код ВАК 4.2.5
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛИПИДНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ И ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ СПЕРМИЕВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Анастасия Сергеевна Метлева1
1Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия, Кемерово, Россия
1zveryski@mail.ru
Аннотация. Целью исследования является изучение возможностей применения спермиев крупного рогатого скота в качестве век
торов доставки генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. Для внедрения ге
нетической конструкции спермии обрабатывались химическим (Lipofectamine CRISPRMAX) и физическим (электропорация) способами
для создания временно проницаемой мембраны, с последующим внедрением рекомбинантной ДНК и оценкой сохранения жизнеспособ
ности и усвоения генетическую конструкцию. Режимы электропорации и липофекция были опробованы на спермиях крупного рогатого
скота для внедрения генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. В результате
проведенных экспериментов установлена эффективность применения липофекции на спермиях крупного рогатого скота, концентрация
жизнеспособных спермиев и доставка генетической конструкции в половые клетки, также установлен наиболее оптимальный режим
электропорации, при котором наблюдаются жизнеспособные спермии с внедренной ген-конструкцией. Полученные результаты позво
лили сформировать технологический регламент по геномному редактированию крупного рогатого скота с использованием спермиев
в качестве вектора доставки генетических компонентов CRISPR/Cas9. Предложенный подход к геномному редактированию животных
мало изучен и освещён в современной литературе. Но он имеет преимущества перед традиционными методами доставки генетической
конструкции в клетки, в том числе в клетки ооцитов. Разработка технологии введения генетической конструкции для геномного редакти
рования методом CRISPR/Сas9 в яйцеклетки крупного рогатого скота путем переноса спермой является альтернативой использованию
вирусных конструкций плазмид и метода микроинъекции.
Ключевые слова: спермии, крупный рогатый скот, CRISPR-Cas9, трансфекция, электропорация, липофекция, геномное редактирование, генетическая конструкция, генно-редактированные животные, вирус лейкоза крупного рогатого скота.
Благодарности: работа проводилась в рамках выполнения 3 этапа комплексного проекта по теме: «Разработка технологии геномного редактирования для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к вирусу лейкоза», соглашение о предоставлении субсидии от «30» ноября 2018 г. № 05.607.21.0208, уникальный идентификатор проекта RFMEFI60718X0208.
Для цитирования: Метлева А.С. Сравнение методов липидной трансфекции и электропорации спермиев крупного рогатого скота // Вестник Курганской ГСХА. 2023. № 1 (45). С. 33-39.
Scientific article
COMPARISON OF METHODS OF LIPID TRANSFECTION AND ELECTROPORATION OF BOVINE SPERM
Anastasia S. Metleva1
1Kuzbass State Agricultural Academy, Kemerovo, Russia
1zveryski@mail.ru
Abstract. The aim of the study is to study the possibilities of using bovine sperm as vectors for delivering the CRISPR/Cas9 genetic con
struct to oocytes to obtain gene-edited animals. For the introduction of the genetic construct, sperm were treated by chemical (Lipofectamine
CRISPRMAX) and physical (electroporation) methods to create a temporarily permeable membrane, followed by the introduction of recombinant
DNA and evaluation of viability and assimilation of the genetic construct. Electroporation and lipofection modes were tested on bovine sperm to
introduce the CRISPR/Cas9 genetic construct into oocytes to obtain gene-edited animals. As a result of the experiments, the effectiveness of the
use of lipofection on sperm of cattle, the concentration of viable sperm and the delivery of the genetic construct to the germ cells were established.
The most optimal electroporation mode was determined, in which viable sperm with the introduced gene construct was observed. The results
obtained made it possible to form a technological regulation for genomic editing of cattle using sperm as a vector for the delivery of CRISPR/
Cas9 genetic components. The proposed approach to genomic editing of animals has been little studied and consecrated in modern literature.
But it has advantages over traditional methods of delivering a genetic construct into cells, including oocyte cells. The development of a technology
for introducing a genetic construct for CRISPR/Cas9 genome editing into bovine eggs by sperm transfer is an alternative to using viral plasmid
constructs and the microinjection method.
Keywords: sperm, cattle, CRISPR-Cas9, transfection, electroporation, lipofection, genome editing, genetic construct, gene-edited animals, bovine leukemia virus.
Acknowledgments: the work was carried out as part of the implementation of the 3rd stage of a comprehensive project on the topic: «Development of genomic editing technology for the reproduction of high-value pedigree dairy cattle resistant to the leukemia virus», subsidy agreement dated 30 November 2018 No. 05.607.21.0208, unique project ID RFMEFI60718X0208.
For citation: Metleva A.S. Comparison of methods of lipid transfection and electroporation of bovine sperm. Vestnik Kurganskoj GSHA. 2023; (1-45). 33-39. (In Russ).
Vestnik Kurganskoj GSHA. 2023; (1-45): 33-39
Научная статья
УДК 636.22/28.082.2 EDN: JUMZSR
Код ВАК 4.2.5
СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ЛИПИДНОЙ ТРАНСФЕКЦИИ И ЭЛЕКТРОПОРАЦИИ СПЕРМИЕВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Анастасия Сергеевна Метлева1
1Кузбасская государственная сельскохозяйственная академия, Кемерово, Россия
1zveryski@mail.ru
Аннотация. Целью исследования является изучение возможностей применения спермиев крупного рогатого скота в качестве век
торов доставки генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. Для внедрения ге
нетической конструкции спермии обрабатывались химическим (Lipofectamine CRISPRMAX) и физическим (электропорация) способами
для создания временно проницаемой мембраны, с последующим внедрением рекомбинантной ДНК и оценкой сохранения жизнеспособ
ности и усвоения генетическую конструкцию. Режимы электропорации и липофекция были опробованы на спермиях крупного рогатого
скота для внедрения генетической конструкции CRISPR/Cas9 в ооциты для получения генно-редактированных животных. В результате
проведенных экспериментов установлена эффективность применения липофекции на спермиях крупного рогатого скота, концентрация
жизнеспособных спермиев и доставка генетической конструкции в половые клетки, также установлен наиболее оптимальный режим
электропорации, при котором наблюдаются жизнеспособные спермии с внедренной ген-конструкцией. Полученные результаты позво
лили сформировать технологический регламент по геномному редактированию крупного рогатого скота с использованием спермиев
в качестве вектора доставки генетических компонентов CRISPR/Cas9. Предложенный подход к геномному редактированию животных
мало изучен и освещён в современной литературе. Но он имеет преимущества перед традиционными методами доставки генетической
конструкции в клетки, в том числе в клетки ооцитов. Разработка технологии введения генетической конструкции для геномного редакти
рования методом CRISPR/Сas9 в яйцеклетки крупного рогатого скота путем переноса спермой является альтернативой использованию
вирусных конструкций плазмид и метода микроинъекции.
Ключевые слова: спермии, крупный рогатый скот, CRISPR-Cas9, трансфекция, электропорация, липофекция, геномное редактирование, генетическая конструкция, генно-редактированные животные, вирус лейкоза крупного рогатого скота.
Благодарности: работа проводилась в рамках выполнения 3 этапа комплексного проекта по теме: «Разработка технологии геномного редактирования для воспроизводства высокоценного племенного крупного рогатого скота молочного направления, устойчивого к вирусу лейкоза», соглашение о предоставлении субсидии от «30» ноября 2018 г. № 05.607.21.0208, уникальный идентификатор проекта RFMEFI60718X0208.
Для цитирования: Метлева А.С. Сравнение методов липидной трансфекции и электропорации спермиев крупного рогатого скота // Вестник Курганской ГСХА. 2023. № 1 (45). С. 33-39.
Scientific article
COMPARISON OF METHODS OF LIPID TRANSFECTION AND ELECTROPORATION OF BOVINE SPERM
Anastasia S. Metleva1
1Kuzbass State Agricultural Academy, Kemerovo, Russia
1zveryski@mail.ru
Abstract. The aim of the study is to study the possibilities of using bovine sperm as vectors for delivering the CRISPR/Cas9 genetic con
struct to oocytes to obtain gene-edited animals. For the introduction of the genetic construct, sperm were treated by chemical (Lipofectamine
CRISPRMAX) and physical (electroporation) methods to create a temporarily permeable membrane, followed by the introduction of recombinant
DNA and evaluation of viability and assimilation of the genetic construct. Electroporation and lipofection modes were tested on bovine sperm to
introduce the CRISPR/Cas9 genetic construct into oocytes to obtain gene-edited animals. As a result of the experiments, the effectiveness of the
use of lipofection on sperm of cattle, the concentration of viable sperm and the delivery of the genetic construct to the germ cells were established.
The most optimal electroporation mode was determined, in which viable sperm with the introduced gene construct was observed. The results
obtained made it possible to form a technological regulation for genomic editing of cattle using sperm as a vector for the delivery of CRISPR/
Cas9 genetic components. The proposed approach to genomic editing of animals has been little studied and consecrated in modern literature.
But it has advantages over traditional methods of delivering a genetic construct into cells, including oocyte cells. The development of a technology
for introducing a genetic construct for CRISPR/Cas9 genome editing into bovine eggs by sperm transfer is an alternative to using viral plasmid
constructs and the microinjection method.
Keywords: sperm, cattle, CRISPR-Cas9, transfection, electroporation, lipofection, genome editing, genetic construct, gene-edited animals, bovine leukemia virus.
Acknowledgments: the work was carried out as part of the implementation of the 3rd stage of a comprehensive project on the topic: «Development of genomic editing technology for the reproduction of high-value pedigree dairy cattle resistant to the leukemia virus», subsidy agreement dated 30 November 2018 No. 05.607.21.0208, unique project ID RFMEFI60718X0208.
For citation: Metleva A.S. Comparison of methods of lipid transfection and electroporation of bovine sperm. Vestnik Kurganskoj GSHA. 2023; (1-45). 33-39. (In Russ).
